新一代測序技術(shù)在爆炸式發(fā)展的同時(shí)，也衍生出許多其他技術(shù)創(chuàng )新。RNA深度測序（RNA-Seq）就是其中之一，這項技術(shù)使我們對細胞發(fā)育及其調控機制的理解，達到了前所未有的深度和廣度。盡管研究細胞RNA并不是什么新鮮事，但RNA-Seq的出現大大拓展了轉錄組研究的規模，取得了累累碩果，這些是傳統技術(shù)難以企及的。

RNA-seq可以獲得相當驚人的數據量，而這恰恰是一柄雙刃劍。豐富的數據量蘊含著(zhù)大量的寶貴信息，但這樣的數據需要復雜的生物信息學(xué)分析，才能從中提取到有意義的結果。正因如此，數據分析可以說(shuō)是RNA-seq的重中之重。

RNA-seq有非常廣泛的應用，但沒(méi)有哪個(gè)分析軟件是萬(wàn)能的�？茖W(xué)家們一般會(huì )根據自己的研究對象和研究目標，采用不同的數據分析策略�，F在人們已經(jīng)發(fā)表了大量的RNA-seq和數據分析方案，對于剛入門(mén)的新手來(lái)說(shuō)難免有些無(wú)所適從。

佛羅里達大學(xué)、加州大學(xué)Irvine分校等單位的研究人員在一月二十六日的Genome Biology雜志上發(fā)表文章，概述了RNA-seq生物信息學(xué)分析的現行標準和現有資源，為人們提供了一份帶有注釋的RNA-seq數據分析指南。這將成為開(kāi)展RNA-seq研究的寶貴參考資料。

這份指南覆蓋了RNA-seq數據分析的所有主要步驟，比如質(zhì)量控制、讀段比對、基因和轉錄本定量、差異性基因表達、功能分析、基因融合檢測、eQTL圖譜分析等等。研究人員繪制的RNA-seq分析通用路線(xiàn)圖（標準Illumina測序），將主要分析步驟分為前期分析、核心分析和高級分析三類(lèi)。前期預處理包括實(shí)驗設計、測序設計和質(zhì)量控制。核心分析包括轉錄組圖譜分析、差異基因表達和功能分析。高級分析包括可視化、其他RNA-seq技術(shù)和數據整合。

研究人員在文章中探討了每個(gè)步驟所面臨的挑戰，也評估了一些數據處理方法的潛力和局限。此外，他們還介紹了RNA-seq數據與其他數據類(lèi)型的整合。這種數據整合可以將基因表達調控與分子生理學(xué)和功能基因組學(xué)關(guān)聯(lián)起來(lái)，如今越來(lái)越受到研究者的歡迎。

這篇文章在結尾處介紹了一些為轉錄組領(lǐng)域帶來(lái)改變的新技術(shù)，特別是單細胞RNA-seq和長(cháng)讀取測序技術(shù)帶來(lái)的機遇和挑戰。

2015年年初，RNA-Seq的數據分析方法如雨后春筍般涌現。三月份，Nature集團旗下刊物發(fā)表了三篇介紹RNA-Seq數據分析新方法的文章，一篇發(fā)表在《Nature Methods》上，另外兩篇發(fā)表在《NatureBiotechnology》上。這三篇文章有一位共同的作者，那就是約翰霍普金斯大學(xué)計算生物學(xué)中心的StevenSalzberg，生物信息學(xué)和計算生物學(xué)領(lǐng)域的杰出科學(xué)家。Salzberg通過(guò)這些文章中分別介紹了三種新工具：HISAT、StringTie和Ballgown。這些工具可以取代之前開(kāi)發(fā)的早期工具，為RNA-Seq提供了全新的數據分析方法，從原始數據讀取到差異表達分析。

RNA測序究竟有多可靠呢？由美國FDA牽頭的測序質(zhì)量控制（SEQC）項目對RNA測序的準確性、可重現性和信息含量進(jìn)行了綜合性評估。其初步調查結果發(fā)表在2014年09月的NatureBiotechnology雜志上，石樂(lè )明教授是這篇文章的通訊作者之一。研究人員用RNA參照樣本在全球多個(gè)實(shí)驗室的Illumina HiSeq、Life Technologies SOLiD、Roche 454平臺上進(jìn)行檢測，主要評估RNA測序在接頭區域和差異性表達譜中的表現，并將其與芯片和定量PCR（qPCR）進(jìn)行比較。研究表明，數據分析的算法會(huì )對RNA測序產(chǎn)生很大影響，不同算法生成的轉錄本數據存在很大差異。

前幾天，浙江大學(xué)和哈佛大學(xué)的研究人員在CellReports雜志上發(fā)表了一項單細胞mRNA-seq研究�；�因表達變異是小鼠胚胎干細胞（ESC）的一個(gè)重要特征，但人們一直不清楚這背后的具體原因。研究人員通過(guò)分析小鼠胚胎干細胞發(fā)現，這些細胞表現出的異質(zhì)性是血清培養造成的。他們在其中鑒定了高度變異的基因簇，以及獨特的染色質(zhì)狀態(tài)。研究顯示，雙價(jià)基因（bivalent gene）更容易出現表達變異。進(jìn)一步研究表明，無(wú)血清培養可以減少小鼠ESC的異質(zhì)性和轉錄組變異。這意味著(zhù)，細胞內的網(wǎng)絡(luò )變異大多是細胞外的培養環(huán)境造成的。

（轉載來(lái)源：轉化醫學(xué)網(wǎng)）