一文帶你讀懂單細胞基因測序市場(chǎng)分析

什么叫做單細胞基因測序（Single-Cell Sequencing）？

一句話(huà)說(shuō)，就是單個(gè)細胞水平上對基因組進(jìn)行測序。2013年，自然雜志把年度技術(shù)授予了單細胞基因測序（Single CellSequencing），認為該技術(shù)將改變生物界和醫學(xué)界的許多領(lǐng)域。

我們?yōu)槭裁匆�進(jìn)行單細胞基因測序？

傳統的測序方法，無(wú)論是基因芯片或者二代基因測序技術(shù)（Next Generation Sequencing，NGS）都需要從超過(guò)10萬(wàn)個(gè)細胞中提取一大堆（bulk）DNA或者RNA，而提供的信息是一大堆細胞的平均值。但是傳統的方法，對于理解人體細胞的多樣性有著(zhù)明顯的局限性。

在人體的每一個(gè)組織中，比如說(shuō)，腎臟組織，擁有著(zhù)大量不同的細胞類(lèi)型，每一種細胞類(lèi)型有著(zhù)獨特的起源和功能。每一個(gè)細胞的譜系和發(fā)展的狀態(tài)又決定了每個(gè)細胞如何和周?chē)�的細胞和環(huán)境如何反應，把基因測序應用到單個(gè)細胞層面，對于我們理解細胞的起源，功能，變異等有著(zhù)至關(guān)重要的作用。

在本篇報告中，我們將詳細解讀單細胞基因測序，以及該技術(shù)對癌癥，輔助生殖以及免疫學(xué)等領(lǐng)域帶來(lái)的新的突破。

一、單細胞基因測序行業(yè)：剛啟程，面臨引爆點(diǎn)

BCC Research的一項分析報告指出，2014年全球單細胞分析（Single-cell Analysis）的市場(chǎng)達5.4億美金，預測將從2015年的6.3億美金增長(cháng)到2020年的16億美金，復合增長(cháng)率達21%。根據GENReports的報告，關(guān)于單細胞分析的文章發(fā)表在過(guò)去的幾年也有著(zhù)爆發(fā)性的增長(cháng)。

 

單細胞分析的文章發(fā)表數量

其中，傳統的單細胞基因組學(xué)主要是由基因芯片和PCR主導的，隨著(zhù)二代基因測序的成本以超摩爾定律下降，目前單細胞基因組學(xué)逐漸由二代基因測序技術(shù)接棒。

和qPCR在90年代的發(fā)展一樣，目前所有的刺激因素（高度的科研興趣，生物醫藥巨頭公司的關(guān)注等）正在解鎖這個(gè)市場(chǎng)，單細胞基因測序行業(yè)正面臨引爆點(diǎn)。

二、單細胞基因測序的基本流程：?jiǎn)渭毎�分離--基因組擴增--測序和分析

單細胞測序，簡(jiǎn)單地說(shuō)，主要經(jīng)過(guò)如下的步驟：?jiǎn)渭毎�的分離--DNA/RNA的提取和擴增（全基因組擴增和全轉錄組擴增）---測序以及后續的分析和應用。

 

單細胞測序的步驟

2.1 單細胞的捕捉和分離

單細胞測序的第一步是單細胞的分離和提取，目前的方法主要有如下幾種方法：流式細胞術(shù)，激光捕獲顯微切割技術(shù)以及微流控技術(shù)。

單細胞分離的三種方式：流式細胞術(shù)，激光捕獲顯微切割以及微流控技術(shù)

1）流式細胞術(shù) （Flow Cytometry）

是指通過(guò)對于懸浮于流體中的細胞或者其他顆粒進(jìn)行定量分析和分選的技術(shù)。在各種流式細胞儀中，大家主要討論的是熒光活化細胞分類(lèi)計FACS（Fluorescence Activated Cell Sorting）系統分離單細胞。定量原理：待測細胞經(jīng)特異性熒光染料染色后，加入樣品管中，經(jīng)過(guò)測量區，由染色后的細胞在激光照射下的熒光產(chǎn)生的電信號來(lái)進(jìn)行定量分析；分選原理：通過(guò)流束形成含有細胞的帶電液滴來(lái)實(shí)現的。

2）激光捕獲顯微切割技術(shù)Laser Capture Microdissection（LCM）

LCM技術(shù)可以在顯微鏡直視下快速、準確獲取所需的單一細胞亞群，甚至單個(gè)細胞，從而成功解決了組織中細胞異質(zhì)性問(wèn)題。其基本原理是通過(guò)一低能紅外激光脈沖激活熱塑模-乙烯乙酸乙烯酯（EVA）膜，在直視下選擇性地將目標細胞或組織碎片粘到該膜上。

3）微流控技術(shù)（Microfluidics）

微流控技術(shù)是一種用于精確控制微量液體的技術(shù)。微流控芯片是實(shí)施該技術(shù)的平臺，通常通過(guò)細微的管道對液體實(shí)施操控，微流控對液體的操控尺度，剛好適合于單細胞樣品的處理操作。

2.2 全基因組擴增 （Whole Genome Amplification. WGA）/ 全轉錄組擴增（Whole Transcriptome Amplification，WTA）：?jiǎn)渭毎麥y序的難點(diǎn)

2.2.1 主要的三種全基因組擴增技術(shù)，各有優(yōu)勢

由于在單細胞中的DNA和RNA的數量非常�。◣讉�(gè)pg），用傳統的測序儀無(wú)法檢測，所以科學(xué)家們必須首先對這些分子進(jìn)行擴增，同時(shí)盡量的減少錯誤。目前的全基因組擴增技術(shù)主要有三種：簡(jiǎn)并寡核苷酸引物PCR擴增（DOP-PCR），多重置換擴增（MDA）；和基于多次退火和成環(huán)的擴增循環(huán)（MALBAC）。

 

表1：三種類(lèi)型的全基因組擴增方式比較

Navin 在研究報告中指出（來(lái)源：Cancer genomics： one cell at a time），對于檢測CNV（Copy Number Variation）的時(shí)候，DOP-PCR以及MALBAC較有優(yōu)勢，另一方面， MDA方法一般用來(lái)檢測點(diǎn)突變。Gawad et al.，（2015）更是指出，三種全基因組擴增技術(shù)并沒(méi)有明顯的勝者，具體方法的使用取決于研究的目的。

2.2.2 全轉錄組擴增

一個(gè)哺乳動(dòng)物的單細胞大約含有10pg的RNA，其中mRNA大約在0.1-0.5pg，并不能滿(mǎn)足目前測序平臺的要求，所以需要進(jìn)行全轉錄組擴增技術(shù)。

單細胞中提取的RNA首先經(jīng)過(guò)逆轉錄出cDNA，然后對逆轉錄生成的cDNA進(jìn)行擴增。目前主要的轉錄組擴增技術(shù)主要包括如下幾種：傳統的PCR，改進(jìn)的PCR，T7-in vitro 體外轉錄組擴增以及Phi29聚合酶擴增。

三、單細胞測序的主要應用：癌癥，輔助生殖以及免疫學(xué)領(lǐng)域

當單細胞被分離，細胞內的DNA/RNA被提取和擴增后，二代基因測序（Next GenerationSequencing）可以用來(lái)進(jìn)行后續的測序。當把基因測序應用于單個(gè)細胞層面，在下游應用領(lǐng)域有著(zhù)先天獨到的優(yōu)勢。

3.1單細胞基因測序技術(shù)有助研究癌癥起因和治療

首先談一下癌癥的異質(zhì)性：中晚期的腫瘤或由一系列的腫瘤克隆組成，每一種克隆有著(zhù)獨立的變異，形態(tài)和藥物反應。對于腫瘤克隆精準的診斷非常重要，因為一個(gè)占據原發(fā)性腫瘤5.1%的亞克隆種群在復發(fā)的時(shí)候可能成為主要的致病因素。

 

腫瘤的異質(zhì)性

實(shí)體瘤由一系列不同的細胞組成，包括癌癥纖維細胞，內皮細胞，淋巴細胞，巨噬細胞等。同時(shí)，實(shí)體瘤由多個(gè)腫瘤克隆亞種群構成，使得臨床樣本的分析更加復雜。當多個(gè)腫瘤克隆同時(shí)存在時(shí)，標準方法檢測的要么是平均信號要么是主要的克隆群體（并不一定是最致病的）的信號。

而同時(shí)，腫瘤的異質(zhì)性和癌癥產(chǎn)生抗藥性以及轉移密切相關(guān)，所以，單細胞測序開(kāi)始用來(lái)檢測腫瘤內基因異質(zhì)性，對于癌癥起因以及后續治療的研究非常關(guān)鍵和重要。

例如，Navin et al.（2011）， 利用單細胞基因測序的方法（流式細胞術(shù)提取細胞-全基因組擴增-NGS），在某個(gè)乳腺癌腫瘤組織中檢測了100個(gè)乳腺癌細胞的CNVs，覆蓋度大約6%，發(fā)現了三種完全不一樣的克隆亞種群。

除了腫瘤細胞，單細胞基因測序同樣可以應用于循環(huán)腫瘤細胞（Circulating tumor cells）和外周血播散腫瘤細胞DTC（disseminated tumor cells），該部分內容將在后續的研究報告中深入討論。

3.2 單細胞基因測序助力輔助生殖

PGS（Pre-implantationGenetic Screening）是胚胎注入前遺傳學(xué)篩查，主要是通過(guò)檢測胚胎的23對染色體結構、數目，來(lái)分析胚胎是否有遺傳物質(zhì)異常；PGD，主要用于檢測胚胎是否攜帶遺傳缺陷的基因。

PGD過(guò)程中，目前主要有三種方式獲得活檢材料：1）卵子的第一極體和第二極體；2）培養至第3天胚胎卵裂期的卵裂球細胞（一般取1-2個(gè)細胞）；3）培養第5天左右的囊胚細胞。

例如，牛津大學(xué)的Dr.Dagan Wells團隊，通過(guò)對囊胚細胞進(jìn)行單細胞基因測序，選擇健康的胚胎植入。另外，謝曉亮教授團隊通過(guò)對女方卵細胞極體細胞進(jìn)行測序，結合胚胎選擇，選擇正常的胚胎移植。

卵母細胞減數分裂產(chǎn)生極體的過(guò)程（注：其中PB1和PB2是第一極體和第二極體）

3.3 單細胞基因測序打開(kāi)免疫報多樣性研究之門(mén)

用單細胞基因測序分析免疫細胞的原因是現存的多樣的病原體導致了免疫細胞的高度異質(zhì)性，傳統的檢測方法，取樣來(lái)自一大堆細胞，低估了單個(gè)免疫細胞的多樣性，所以我們需要更加精確檢測單個(gè)免疫細胞的遺傳物質(zhì)，從而理解機體復雜的免疫機制。正如開(kāi)篇提到的Juno收購的單細胞基因測序公司AbVitro致力于T細胞和B細胞的基因測序。

下圖展示了對單個(gè)T細胞受體基因測序（TCR Sequencing）的流程。TCR α和βmRNA經(jīng)過(guò)逆轉錄，擴增，重疊延伸，目的基因被選擇性地進(jìn)行PCR擴增以及后續的分析。

TCR Sequencing過(guò)程

四、單細胞基因測序未來(lái)的發(fā)展之路

在目前來(lái)看，單細胞基因測序還處在非常初級的階段，也面臨很多技術(shù)的挑戰，包括：如何高效的分離細胞，全基因組無(wú)偏差的擴增，以及下游的數據分析等。但各大生物醫藥巨頭都已經(jīng)目光鎖定了這個(gè)方向，除了今年初Juno收購AbVitro（單個(gè)T細胞和B細胞進(jìn)行基因測序），去年八月BD公司收購了單細胞測序公司Cellular Research。Illumina也通過(guò)和Clontech合作，推出了單細胞RNA測序服務(wù)。

我們認為，未來(lái)的基因測序一定朝著(zhù)更精準，更微觀(guān)的方向前進(jìn)，如今，單細胞測序正面臨著(zhù)一場(chǎng)革命，在單個(gè)細胞層面讓我們在前所未有的水平理解基因組學(xué)，表觀(guān)基因組學(xué)和轉錄組學(xué)的多樣性。

（轉載來(lái)源：微流控）